当合成生物学照进现实：细菌蛋白的七十二变

你是否想过，一个微小的细菌蛋白，经过科学家的巧手改造，竟能化身探测肿瘤、农药、染料乃至工业废水的“万能钥匙”？

发表在《Nucleic Acids Research》的研究“Divergent directed evolution of a TetR-type repressor towards aromatic molecules”，揭示了这一突破性成果：研究人员通过定向进化技术，让一种原本专一识别特定化学物质的细菌蛋白（RolR 蛋白），获得了识别多种芳香族分子的能力，甚至能跨物种在酵母中发挥作用，为生物传感、环境监测和疾病诊断打开了新天地。

RolR 蛋白：天然“专一者”的改造潜力

RolR 蛋白质源自谷氨酸棒状杆菌，属于 TetR 家族阻遏蛋白。在自然界中，它功能专一明确：通过识别并结合“间苯二酚”（广泛用于工业生产的化学品），调控细菌基因表达，帮助细菌应对环境中的间苯二酚，趋利避害。

这种“专一性”在科研中既是优势也是局限。科学家们意识到，若能让 RolR“学会”识别更多分子，就能开发出低成本、高灵敏度的生物传感器，应用于环境监测（如检测工业废水中的有害芳香族物质）、药物合成（实时监测药物中间体浓度）乃至疾病诊断（识别与疾病相关的分子标志物）。 

定向进化：三步打造“多面手”蛋白

为让 RolR 获得新能力，研究人员采用“定向进化”技术，模拟自然进化过程加速功能优化，分三个关键步骤推进：

① 精准突变：锁定“结合口袋”

RolR 通过“配体结合口袋”识别底物间苯二酚，口袋的形状和氨基酸组成决定其能结合的分子种类。研究人员筛选出 19 个位于口袋内或附近的关键氨基酸。通过“组合活性位点饱和测试（CAST）”和“迭代饱和诱变（ISM）”技术，对这些氨基酸进行精准突变，创造海量 RolR 变体（图 1.A-C）。值得注意的是，研究人员特意保留氨基酸 D149——这是 RolR 识别间苯二酚的“关键抓手”，突变会导致其完全失去功能。

② 双重选择：筛选“合格选手”

突变后的变体库中，只有少数能同时满足两个条件：既能正常结合 DNA 调控基因（保证基础功能），又能被新目标分子“激活”（获得新功能）。研究人员利用 TetA antiporter 蛋白设计了“双重选择”系统（图 1D，图 2）： 

负选择：在含 NiCl₂ 的培养基中，只有能正常抑制基因表达的变体才能存活（避免 TetA 蛋白过量导致的毒性）；

正选择：在含四环素的培养基中，只有能被新分子激活、表达 TetA 的变体才能存活。

这种筛选方式可以高效剔除“不合格”变体，最终留下“功能完备+新分子响应”的优质候选者。

③ 多代迭代：优化性能

研究团队并未止步于第一代变体。他们以识别儿茶酚的变体为模板，继续突变优化，最终获得了能识别 6 种新分子的 RolR 变体，包括：

儿茶酚（木质素降解产物，用于合成染料、农药）；

甲基儿茶酚（lignin 降解副产物）；

咖啡酸（药物合成中间体）；

原儿茶酸（药物合成中间体）；

L - 多巴（治疗帕金森病的前体）；

高香草酸（肿瘤标志物，与神经母细胞瘤相关）。

跨物种应用：突破宿主限制

生物传感器的实用性，很大程度上取决于它能否在不同宿主中工作。研究团队将改造后的 RolR 变体“移植”到酿酒酵母（一种常用的真核生物模型）中（图 3），发现：

野生型 RolR 在酵母中仍专一识别间苯二酚，无交叉反应；

儿茶酚响应变体 CAQ101 在酵母中能产生~10 倍荧光信号，且没有在细菌中出现的“钟形响应”（高浓度下信号反而下降）；

甲基儿茶酚响应变体 MC3 的灵敏度比第二代提升约 3 倍。

从专一识别间苯二酚，到成为能分辨多种分子的“多面手”，RolR 的改造历程展示了合成生物学的核心魅力——通过精准操控生物分子，能赋予生命全新的功能，解决人类面临的实际问题。这套定向进化框架不仅适用于 RolR，还能推广到其它 aTF 和配体结合蛋白，为开发更多“定制化”生物传感器打开了大门。或许在不久的将来，这些微小的蛋白质传感器会走进我们的生活，成为环境、健康和工业生产的“隐形守护者”。 

本研究中，科学家们使用 QPix-460 菌落挑取仪从琼脂平板上挑取约 480 个菌落，将其移入 5 个 96 孔板中（孔板内含有添加了 50μg/ml 卡那霉素的 LB 培养基），并在 37°C 条件下培养 16 小时，以进行变体表征（图 1.E）。

QPix-460 

是 Molecular Devices 公司推出的一款高通量自动化菌落挑取仪（colony picker），主要应用于微生物学、分子生物学及合成生物学等领域的实验操作。其核心功能是：

实现菌落的自动化挑取、接种、复制和筛选，通过光学成像系统精准识别琼脂平板上的菌落，再结合机械臂系统完成高效转移，可显著减少人工操作误差，提升实验效率。

该设备适用于处理多种规格的培养皿和微孔板（如 96 孔板、384 孔板等），支持高通量筛选场景（如变体库筛选、文库构建等）。

每小时可挑取数千个菌落，能满足大规模实验对速度和重复性的需求，是自动化实验室中用于菌落分离、纯化及后续分析的重要工具。

参考文献：Nasr MA, Martin VJJ, Kwan DH. Divergent directed evolution of a TetR-type repressor towards aromatic molecules. Nucleic Acids Res. 2023. 11;51(14):7675-7690.